style="width:5.26673in;height:4.93988in" /> 本文是学习GB-T 34750-2017 副猪嗜血杆菌检测方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了副猪嗜血杆菌的分离与鉴定、巢式 PCR 检测和实时荧光 PCR
检测方法。
本标准适用于对猪的肺脏、心脏、脑等组织，胸腔、腹腔、心包积液或关节液，抗凝血，细菌培养物等
样品中副猪嗜血杆菌的检测。
下列缩略语适用于本文件。
bp:碱基对(Base Pair)
DNA: 脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)
dNTPs: 脱氧核糖核苷三磷酸(Deoxyribonucleoside Triphosphates)
MGB: 小沟结合(Minor Groove Binder)
NAD: 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)
PBS: 磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution)
PCR: 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)
Taq 酶：Taq DNA 聚合酶(Taq DNA Polymerase)
TE:Tris-EDTA 缓冲液(Tris-EDTA Buffer)
TSA: 胰蛋白胨大豆琼脂(Tryptic Soy Agar)
TSB: 胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptic Soy Broth)
3.6 高速冷冻离心机(12000×g 以上)。
3.9 单道微量移液器(0.5μL～10μL;2μL～20μL;20μL～200μL;100μL～1000μL)。
3.11 凝胶成像系统(或紫外投射仪)。
GB/T 34750—2017
4.2 0.2 mL PCR 薄壁管或八联管。
5.1 TSA 培养基和TSB 培养基(见附录 A)。
5.2 NAD 贮存液(见附录 A),2℃~8℃ 条件下保存。
5.3 革兰氏染色试剂：含草酸铵结晶紫染液、卢戈氏(Lugol)
碘液、95%乙醇和沙黄(蕃红)染液，常温条 件下保存。
5.4
葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、半乳糖、木糖等微量生化鉴定管，2℃~8℃条件下保存。
5.5
3%过氧化氢、0.8%磺胺酸冰醋酸溶液、0.5%α-萘胺乙醇溶液、0.1%盐酸二甲基对苯二胺(见附录
A), 常温条件下保存。
5.6 消化液 I 和 TE 缓冲液(见附录 B), 常温条件下保存。
5.7 1×TAE 核酸电泳缓冲液、酚-氯仿-异戊醇混合液(25+24+1)、0.01 mol/L(pH
7.2)的 PBS、 阿氏 液等试剂(见附录 B),6×
电泳上样缓冲液，75%乙醇，以上试剂2℃~8℃条件下保存。
5.8 组织悬液、消化液Ⅱ(见附录 B), 异丙醇，DNA 标准分子量，置-20℃保存。
5.9 阳性对照、阴性对照(见附录 B)。
5.10 巢式 PCR 扩增用上、下游引物序列(见附录 C)。
5.11 副猪嗜血杆菌巢式 PCR 检测反应体系(见附录 D)。
5.12 副猪嗜血杆菌实时荧光 PCR 扩增用上、下游引物及探针序列(见附录 C)。
5.13 副猪嗜血杆菌实时荧光 PCR 检测反应体系(参见附录 E)。
无菌采集疑似副猪嗜血杆菌感染病死猪的肺脏、心脏、脑等新鲜组织，胸腔、腹腔、心包积液或关节
液，抗凝血等样品。采集或处理的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24 h。
采集的样品密封后，采
用保温壶或保温桶加冰密封，运送到实验室。
6.2.1 在生物安全柜中用接种环无菌蘸取样品划线接种于 TSA
固体培养基上，37℃培养24 h～48h, 使之形成菌落，以供鉴定用。
6.2.2 取6.2.1 中培养的针尖大小(直径约1 mm～2mm)、
圆形、隆起、光滑湿润、无色透明、边缘整齐 的小菌落，在TSA
固体培养基上进行划线接种纯培养，37℃培养24 h～48h 后，出现上述小菌落。
6.3.1
涂片在载玻片上滴加1～2滴灭菌蒸馏水后，挑取纯培养的小菌落与灭菌蒸馏水混匀并涂成薄
菌膜。
6.3.2 干燥将涂片于空气中自然晾干。
6.3.3 固定将已干燥的载玻片涂面朝上，在酒精灯火焰上通过5次～6次进行固定。
6.3.4
染色采用革兰氏染色法进行染色，具体操作按照革兰氏染色试剂盒说明书进行，置1000倍
(10×100)光学显微镜下观察。
6.3.5
镜检副猪嗜血杆菌为革兰氏染色阴性短杆状或球杆状小杆菌，菌体大小不等，约0.5μm×
(1.5μm～2.0μm), 以纤细杆状居多、无鞭毛，不形成芽孢。
GB/T 34750—2017
在生物安全柜中无菌挑取纯化培养后的单个菌落，平行划线于无NAD
的绵羊鲜血平板上，再挑取 金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线，37℃条件下培养24
h～48h 后，观察菌落生长情况，副猪嗜血杆
菌无溶血，并具有"卫星生长现象"(金黄色葡萄球菌周围的副猪嗜血杆菌菌落较大，而远离葡萄球菌的
副猪嗜血杆菌菌落较小)。
在生物安全柜中无菌挑取具有"卫星生长现象"且不溶血的单菌落在 TSA
固体培养基上进行再次 纯培养后，挑取单个菌落接种于5 mLTSB
液体培养基中，37℃培养24 h～48h 后，液体变混浊，判为
增殖培养成功。
在生物安全柜中无菌将生化鉴定管打开，每管按10μg/mL 终浓度加入NAD,
用接种针无菌挑取
6.5中增殖培养的菌液分别接种于葡萄糖、乳糖、半乳糖、甘露醇、木糖等微量生化鉴定管中，37℃培养
24h,
观察结果，发酵葡萄糖、半乳糖，不发酵乳糖、甘露醇、木糖者为阳性，否则为阴性。
吸取6.5中增殖培养的菌液1滴于洁净玻片上，然后滴加1滴3%过氧化氢混匀，30
s 内观察反应
结果，立即出现大量气泡者判为阳性，无气泡者判为阴性。
将0.8%磺胺酸冰醋酸溶液和0.5% a-萘胺乙醇溶液各0.2 mL
混合，取混合试剂0.1 mL 加至6.5
中增殖培养菌液中，立即观察结果，呈现红色者为阳性，无红色出现者为阴性。
吸取6.5中增殖培养的菌液100μL
接种于尿素酶试验液体培养基管中，摇匀，于37℃培养
10 min,60 min和120 min
后分别观察结果，粉红色者判为阳性，不变色者判为阴性。
吸取6.5中增殖培养菌液1滴于洁净载玻片上，加盐酸二甲基对苯二胺溶液1滴，2
min 内观察结
果，呈现鲜蓝色者判为阳性，2 min 内不变色者判为阴性。
按照全自动微生物鉴定仪使用说明书将6.5中增殖培养的细菌进行微生物鉴定。
糖类发酵试验结果为发酵葡萄糖、半乳糖，不发酵乳糖、甘露醇、木糖；触酶、硝酸盐还原试验结果均
为阳性；尿素酶、氧化酶试验结果均为阴性的判定为副猪嗜血杆菌阳性；或全自动微生物鉴定仪鉴定结
果为副猪嗜血杆菌阳性的，判定为副猪嗜血杆菌阳性。
GB/T 34750—2017
7.1.1.1 组织样品
采取有明显病变的肺脏、心脏、脑等新鲜组织样品。用无菌剪刀和镊子剪取待检样品0.5
g 左右于
组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，加入0.3 mL～0.5
mLPBS混匀，将组织悬液转入无菌离心管
中，编号备用。
7.1.1.2 积 液
用无菌注射器采集胸腔、腹腔积液或关节液2 mL～3mL,
转至无菌离心管中，编号备用。
7.1.1.3 抗凝血
用无菌注射器先吸入抗凝剂(阿氏液)2 mL～3mL,
自耳静脉或前腔静脉采集等量血液，快速混匀
后转入无菌离心管中，编号备用。
7.1.1.4 增菌培养物
用无菌滴头吸取增菌培养物500 μL 于无菌离心管中，编号备用。
采集或处理的样品在2℃~8℃条件下保存应不超过24 h。
采集的样品密封后，采用保温壶或保
温桶加冰密封，运送到实验室。
警示：酚-氯仿-异戊醇具有毒性，小心操作!
7.2.1 取1.5 mL
无菌离心管，于各管中分别加入待测样品、阴性对照、阳性对照各100μL, 再加入
500μL 消化液I 和 1 0 μL 消化液Ⅱ,吸头反复吸打混匀( 一份样品换用
一个吸头);置55℃水浴
7.2.2 分别加入500μL 酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀，于4℃条件下12000
r/min 离心10 min。
7.2.3 分别吸取离心后的上清液转移至新的1.5 mL
无菌离心管中(注意不要碰到中间层),加入等体
积-20℃预冷的异丙醇，混匀，室温放置15 min。
7.2.4 4℃条件下12000 r/min 离心15 min
(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上
清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加入700μL75%
乙醇，轻轻 混匀。
7.2.5 4℃条件下12000 r/min 离 心 5 min
(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置)。轻轻倒去上清
液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。
7.2.6 4℃条件下12000 r/min 离心30 s,
将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸 干，
一份样品换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，真空抽干3 min～5min
或室温干燥10 min。
7.2.7 加入10 μLTE 缓冲液，轻轻混匀，溶解 DNA,2000 r/min 离心5 s, 置-
20℃冻存备用。
7.2.8 样 品DNA 的制备可采用上述提取方法也可采用商品化的试剂盒提取。
GB/T 34750—2017
7.3.1.1 配制 PCR 反应体系I (见附录D室温融化后，瞬时离心使液体全部聚集在管底部，向每管中 加入7.2.7中相应 DNA
2μL,经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底。
7.3.1.2 PCR 扩增条件95℃预变性5 min 后，94℃ 45
s,58℃ 45s,72℃ 45s 共35个循环，最后
72℃延伸10 min。 反应结束后取出置于2℃~8℃条件下保存。
7.3.2.1 配制 PCR
反应体系Ⅱ室温融化后，瞬时离心使液体全部聚集在管底部，向每管中加入7.3.1.2
中相应的PCR 产 物 2 μL,经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底。
7.3.2.2 PCR 扩增条件同7.3.1.2。
称取1.2 g 琼脂糖加入100 mL
核酸电泳缓冲液中加热至沸腾，充分溶化后放凉至50 ℃左右，加入
核酸染色剂10μL, 混匀，倒入胶槽制备凝胶板。在电泳槽中加入1×TAE
核酸电泳缓冲液，使液面刚
刚没过凝胶。分别取样品 PCR 扩增产物、阴/阳性对照扩增产物10μL 和 2 μL6×
电泳上样缓冲液混
合后，分别加样到各凝胶孔中，取5μLDNA 分子量标准加到一凝胶孔中。5 V/cm
恒压下电泳30 min
左右，将电泳好的凝胶置紫外投射仪或凝胶成像系统中观察结果，进行判定并做好试验记录。
副猪嗜血杆菌阳性对照的巢式 PCR 扩增产物电泳后在312 bp
位置出现特异性条带，同时阴性对
照的 PCR 扩增产物电泳后没有任何条带(参见附录 F),
则试验结果成立；否则结果不成立。
在试验结果成立的前提下，如果样品的 PCR 产物电泳后在312 bp
位置上出现特异性条带，判定为
副猪嗜血杆菌核酸检测阳性。
在试验结果成立的前提下，如果样品在312 bp
位置未出现特异性条带，判定为副猪嗜血杆菌核酸
检测阴性。
8 副猪嗜血杆菌实时荧光 PCR 检测
样品的采集、处理、存放及运送应符合7.1的规定。
样品 DNA 的制备应符合7.2的规定。
GB/T 34750—2017
8.3.1 在检测区配制与8.2中相同数量的实时荧光 PCR
反应体系，向每管中加入8.2中相应 DNA 2μL,
充分混匀后并使液体全部聚集于管底，按照要加样品的顺序摆放好实时荧光PCR
反应管。
8.3.2 将8.3.1中加样后的实时荧光PCR 反应管放入实时荧光定量 PCR
仪内并记录样本摆放顺序。
8.3.3 反应参数设置：第一阶段，预变性94℃/5 min;第二阶段，94℃/30
s,60℃/30 s,40个循环，在
每个循环的延伸结束时进行荧光信号收集，荧光模式设为FAM/NONE
双标记模式。
读取检测结果，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根
据仪器噪音情况进行调整。
阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且 C, 值>32 . 0或无；阳性对照的
C. 值应≤29 .0,且出
现特定的扩增曲线(参见附录F);如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为无效。
8.4.3.1 阳 性
C. 值≤29.0,而且出现特定的扩增曲线，则判定为阳性。
8.4.3.2 阴性
C. 值>32 .0或无，并且无特定的扩增曲线，则判定为阴性。
8.4.3.3 可疑
29.0\<C. 值≤32 .
0且有特定的扩增曲线的样品应重做，结果为阳性者判定为阳性，否则判定为
阴性。
8.4.3.4 无效扩增
如果阳性对照没有扩增曲线，或者阴性对照有C,
值\<32.0的扩增曲线，判定本次实验无效，需要分
析试验失败原因，并重新试验。
GB/T 34750—2017
(规范性附录)
副猪嗜血杆菌分离培养和生化鉴定试剂的配制
A.1 TSA 固体培养基的配制
A.1.1 称取 TSA 40 g, 加入940 mL
蒸馏水，充分摇匀后加热至充分溶解，121 ℃高压蒸汽灭菌
A.1.2 冷却至45℃左右，加入50 mL 过滤除菌的小牛血清、10 mL
过滤除菌的1% NAD, 充分摇匀后
制备固体培养平板，2℃~8℃条件下保存。
A.2 TSB 液体培养基的配制
A.2.1 称取 TSB30 g,加入949 mL
蒸馏水，加热至充分溶解后摇匀，121℃高压蒸汽灭菌15 min,
2℃~8℃条件下保存。
A.2.2 使用前，加入50 mL 过滤除菌的小牛血清、1 mL 过滤除菌的1% NAD。
A.3 NAD 贮备液的配制
称取1 gNAD 溶解于100 mL 蒸馏水中，充分摇匀溶解后，用0.22 μm
的细菌滤器过滤，分装于无
菌离心管中，置-20℃保存备用。
A.4 硝酸盐还原试验试剂的配制
称取磺胺酸0.8 g,加入100 mL 冰醋酸配制成0.8%磺胺酸冰醋酸溶液；称取0.5 g
a-萘胺，加入
100mL 乙醇，配制成0.5%α-萘胺乙醇溶液。
A.5 0.1% 二盐酸二甲基对苯二胺溶液的配制
称取二盐酸二甲基对苯二胺0.1 g,加入10 mL
蒸馏水，即可配制成0.1%二盐酸二甲基对苯二胺
溶液。
GB/T 34750—2017
(规范性附录)
副猪嗜血杆菌巢式 PCR 和实时荧光 PCR 检测试剂的配制
B.1 消化液 I 的配制
Tris-HCl(pH 8.0)终浓度10 mmol/L;EDTA(pH 8.0)终浓度25 mmol/L;SDS
终浓度200 μg/mL;
NaCl 终浓度100 mmol/L。
B.2 TE 缓冲液的配制
Tris-HCl(pH 8.0)终浓度为10 mol/L,EDTA(pH
B.3 1×TAE 核酸电泳缓冲液的配制
Tris碱，24.2 g;冰乙酸，5.71 mL;0.5 mol/L
8.0)终浓度为1 mol/L。
EDTA(pH8.0),10mL;加蒸馏水至100 mL, 使用时
用蒸馏水作50倍稀释，即为1×TAE 核酸电泳缓冲液。
B.4 酚-氯仿-异戊醇溶液的配制
Tris饱和酚-氯仿-异戊醇按25:24:1的比例混合。
B.5 0.01 mol/L(pH7.2)的磷酸盐缓冲液(PBS) 的配制
B.5.1 A 液(0.2 mol/L 磷酸二氢钠水溶液):NaH₂PO₄ ·H₂O 27.6
B.5.2 B 液(0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液):Na₂HPO₄ · 12H2O71.6
B.5.3 0.01 mol/LPBS 的配制：A 液 1 4 mL,B 液36 mL, 加 NaCl8.5
g, 用适量蒸馏水溶解，定容至 g,用适量蒸馏水溶解，定容至
g,用蒸馏水定容至1000 mL;
121℃高压灭菌15 min,4 ℃保存备用。
B.6 阿氏液的配制
葡萄糖2.05 g,柠檬酸钠0.8 g,柠檬酸0.055 g,氯化钠0.42 g,
加蒸馏水定容至100 mL, 溶解后调
pH 至6.1,69 kPa,15 min 高压灭菌，4℃保存备用。
B.7 组织悬液的配制
在0.01 mol/LPBS 液中添加青霉素(2000 IU/mL), 链霉素(2 mg/mL)、
庆大霉素(50 pg/mL) 和
制霉菌素(1000 IU/mL), 置 - 20℃保存备用。
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B.8 消化液Ⅱ的配制
称取100 mg 蛋白酶 K 溶解于5 mL 灭菌水中。
B.9 阳性对照
灭活的副猪嗜血杆菌标准菌株。
B.10 阴性对照
灭菌的 TSB 培养基。
GB/T 34750—2017
(规范性附录)
副猪嗜血杆菌巢式 PCR 和实时荧光 PCR
检测方法所用引物序列
C.1 副猪嗜血杆菌巢式 PCR 扩增用上、下游引物序列
副猪嗜血杆菌巢式 PCR 扩增用上、下游引物序列见表C.1。
表 C.1 副猪嗜血杆菌巢式 PCR 扩增用上、下游引物序列
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|---|---|---|---|
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820 bp; 312 bp |
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C.2 副猪嗜血杆菌实时荧光 PCR
检测方法所用上、下游引物及探针序列
副猪嗜血杆菌实时荧光 PCR 检测方法所用上、下游引物及探针序列见表 C.2。
表 C.2 副猪嗜血杆菌实时荧光 PCR
扩增用上、下游引物及探针序列
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|---|---|---|---|
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58 bp |
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GB/T 34750—2017
(规范性附录)
副猪嗜血杆菌巢式 PCR 反应体系组成、说明及使用注意事项
D.1 检测反应体系组成
检测反应体系组成见表D.1。
表 D.1 副猪嗜血杆菌巢式 PCR 检测反应体系组成
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|---|---|
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12 mL |
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12 mL |
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15 mL |
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20 mL |
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600 μL |
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20 mL |
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50 μL |
D.2 说 明
D.2.1 PCR 反应体系 I 成分：10×PCR 缓冲液(含 Mg²+),2.5μL;2.5 mmol/L
dNTPs,2μL;P1,
0.5μL;P2,0.5μL;ExTaq DNA 聚合酶，0.25μL(5U); 灭菌双蒸水，17.25μL;
总体积为23μL。
D.2.2 PCR 反应体系Ⅱ成分：10×PCR 缓冲液(含 Mg²+),2.5μL;2.5 mmol/L
dNTPs,2μL;P3,
0.5μL;P4,0.5μL;Ex Taq DNA 聚合酶，0.25 μL (5 U);灭菌双蒸水，17.25μL;
总体积为23μL。
D.2.3 PCR 反应体系中含副猪嗜血杆菌标准株特异性引物对、Ex Taq
酶及各种离子。
GB/T 34750—2017
D.3 使用时的注意事项
D.3.1 由于阳性样品中模板浓度相对较高，注意检测过程中不得交叉污染。
D.3.2 注意防止试剂组分污染，不同检测体系之间的成分勿混用。
D.3.3 请按照说明书要求分别在4℃、
-20℃保存不同的试剂，试剂盒有效期为6个月。使用时在室
温下融化，暂放置冰上，使用后立即放回。
D.3.4 PCR
反应体系应避免反复冻融，在使用前应瞬时离心，以保证反应液集中在管底。
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(资料性附录)
副猪嗜血杆菌实时荧光 PCR
检测反应体系组成、说明及使用注意事项
E.1 检测反应体系组成
检测反应体系组成见表 E.1。
表 E.1 副猪嗜血杆菌实时荧光 PCR 检测反应体系组成
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|---|---|
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12 mL |
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12 mL |
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15 mL |
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20 mL |
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360 μL |
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300 pL |
E.2 说明
荧光PCR 反应液成分：10×PCR 缓冲液(含 Mg²+),2.5μL;2.5 mmol/L
dNTPs,2μL;Ex Taq DNA 聚合酶，0.25μL(5U);FQ-P1,0.5μL;FQ-P2,0.5μL;
探针，1μL; 灭菌双蒸水，16.25μL; 总体积
为23μL。
E.3 使用时的注意事项
E.3.1 由于阳性样品中模板浓度相对较高，注意检测过程中不得交叉污染。
E.3.2 注意防止试剂组分污染，不同检测反应体系之间的成分勿混用。
E.3.3 按照说明书要求分别在2℃~8℃、
-20℃保存不同的试剂，试剂盒有效期为6个月。使用时
在室温下融化，暂放置于冰上，使用后立即放回。
E.3.4
反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污
染仪器。
GB/T 34750—2017
(资料性附录)
副猪嗜血杆菌巢式 PCR 产物电泳图及实时荧光 PCR
扩增曲线图
F.1 副猪嗜血杆菌巢式 PCR 产物电泳图
副猪嗜血杆菌巢式 PCR 产物电泳图见图 F.1。
style="width:5.26673in;height:4.93988in" />
说明：
M— 100 bp DNA分子量标准；
图 F.1 副猪嗜血杆菌巢式 PCR 扩增图
F.2 猪嗜血杆菌实时荧光 PCR 扩增曲线图
副猪嗜血杆菌实时荧光 PCR 扩增曲线图见图F.2。
style="width:3.09333in" />GB/T 34750—2017
style="width:9.92002in;height:5.47338in" />
循环数
图 F.2 副猪嗜血杆菌实时荧光PCR 扩增曲线图
更多内容 可以 GB-T 34750-2017 副猪嗜血杆菌检测方法. 进一步学习